Genetika tadqiqotlarini o'tkazish jarayonida biz ko'pincha RNK namunalarini, masalan, kichik anatomik og'iz o'smalarini, hatto bir hujayrali namunalarni va inson hujayralarida juda past darajada transkripsiyalangan o'ziga xos gen mutatsiyalarining namunalarini o'rganish uchun etarli emasligiga duch kelamiz.Albatta, COVID-19 testi uchun, agar tamponlar to'g'ri joyda bo'lmasa yoki namuna olish vaqtida etarli vaqt bo'lmasa, namuna hajmi juda past bo'ladi, shuning uchun Sog'liqni saqlash va oilani rejalashtirish komissiyasi ikki kun oldin chiqdi va sinovdan o'tdi va agar nuklein kislota namunasi oluvchi oltita namunani olmagan bo'lsa, siz bu haqda xabar berishingiz mumkin.
Reagentning sezgirligi muhim, chunki bizda bu yoki boshqa muammo bor, shuning uchun RT-PCR sezgirligini yaxshilash uchun nima qilishimiz mumkin?
Mumkin bo'lgan echimlarni muhokama qilishdan oldin, biz yuqorida aytib o'tgan vaziyatning ikkita katta murakkabligini eslatib o'tamiz.
Birinchidan, namunamizda bir nechta hujayra populyatsiyasi bo'lsa, biz RNK yo'qolishidan xavotirdamiz.An'anaviy ajratish va tozalash usullari, masalan, ustun usuli yoki nuklein kislotani cho'ktirish usuli qo'llanilsa, bir nechta namunalarni yo'qotish ehtimoli yuqori.Yechimlardan biri tRNK kabi tashuvchi molekulani qo'shishdir, ammo shunga qaramay, bizning tiklash tajribamiz yaxshi ekanligiga kafolat yo'q.
Xo'sh, qanday yaxshi yo'l bor?Madaniy hujayralar yoki mikroanatomik namunalar uchun yaxshi variant to'g'ridan-to'g'ri lizizdan foydalanishdir.
Maqsad: hujayralarni 5 daqiqaga bo'lish, RNKni eritmaga chiqarish, so'ngra reaktsiyani 2 daqiqaga to'xtatish, so'ngra lizatni to'g'ridan-to'g'ri teskari transkripsiya reaktsiyasiga qo'shib, RNK yo'qolmasligi va nihoyat hosil bo'lgan cDNKni to'g'ridan-to'g'ri qo'yishdir. real vaqt reaksiyasiga.
Cheklangan boshlang'ich nuqtasi yoki maqsadli gen ifodasining oz miqdori tufayli biz barcha RNKni qayta ishlay olsak-da, real vaqt rejimida yaxshi signal olish uchun etarli shablonlarni taqdim qilmasak-chi?
Bunday holda, oldindan kuchaytirish bosqichi juda foydali bo'lishi mumkin.
Quyida teskari transkripsiyadan keyin sezgirlikni oshirish sxemasi keltirilgan.Ishni boshlashdan oldin, biz qaysi maqsadlarni qiziqtirayotganimizni quyi oqimdan so'rashimiz kerak, shunda oldindan kuchaytirish uchun ushbu maqsadlar uchun maxsus primerlarni loyihalashtiramiz.
Bunga 100 juft astargacha va 10 dan 14 martagacha bo'lgan reaktsiya aylanishiga ega aralash primer yaratish orqali erishish mumkin.Shuning uchun, olingan cDNKni oldindan kuchaytirish uchun ushbu talab uchun maxsus ishlab chiqilgan Master Mix kerak.
10 dan 14 gacha tsikllar sonini belgilashning sababi shundaki, bu cheklangan miqdordagi tsikllar turli maqsadlar o'rtasidagi tasodifiylikni ta'minlaydi, bu miqdoriy molekulyar ma'lumotlarga muhtoj bo'lgan tadqiqotchilar uchun juda muhimdir.
Oldindan kuchaytirilgandan so'ng, biz ko'p miqdordagi cDNKni olishimiz mumkin, shunda orqa tomonda aniqlash sezgirligi sezilarli darajada yaxshilanadi va biz hatto namunani suyultirishimiz va mumkin bo'lgan tasodifiy xatolarni bartaraf etish uchun bir nechta real vaqtda PCR reaktsiyalarini bajarishimiz mumkin.
Yuborilgan vaqt: 2023 yil 11 aprel